Quand le duc de Milan est sauvagement assassiné, Giovanni Auditore, un Assassin, est chargé de mener l'enquête. Sa mission : trouver les coupables et en apprendre plus sur leurs motivations. Les réponses qu'il obtient impliquent les familles les plus puissantes d'Italie, et tout le ramène au Vatican. Dès lors, la vie de Giovanni, qui est sur le point de découvrir la vérité, est menacée. Il doit démasquer les conjurés avant de rejoindre la longue liste de leurs victimes Ces événements se déroulent avant ceux d'Assassin's Creed 2.
